细胞培养常见问题及其解决 - 行业新闻 - 业内资讯

一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时，则应使用5 % CO2 培养细胞。

7.Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？

HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。

8. 细胞之接种密度为何？

依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。

9. 悬浮性细胞应如何继代处理？

一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。

10.冷冻管应如何解冻？

取出冷冻管后，须立即放入37 °C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。

11. 细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？

除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。

12. 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？

一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20 °C，避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低，并可减少污染之机会。

13.欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？

欲回收动物细胞，其离心速率一般为300xg (约1,000rpm)，5 - 10 分钟，过高之转速，将造成细胞死亡。

14. 细胞冷冻培养基之成份为何？

动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO 直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。

15.DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？

冷冻保存使用之DMSO 等级，必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)，其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4°C，避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。若要过滤DMSO，则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。

16.冷冻保存细胞之方法？

冷冻保存方法一: 冷冻管置于4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟*) → -80 °C 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。

冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 °C 至–80 °C 以下，再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 °C 不可超过1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

17. 细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？

冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial，融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。

18.培养基中是否须添加抗生素？

除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。

19.应如何避免细胞污染？

细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。

20.如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？

原则上：直接灭菌后丢弃之。

当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。
高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。

1.在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。

2.分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。

3.每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。

4.确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2～3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2～3代。

5.在无抗生素的培养基中培养细胞一代。

6.重复步骤4。

7.在无抗生素的培养基中培养4～6代，确定污染是否以已被消除。

21.支原体(mycoplasma) 污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？

不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。

22.支原体污染会对细胞培养有何影响？

支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。

23. 侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？

直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。

24. CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？

定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。

25.为何培养基保存于4 °C 冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性？

培养基保存于4 °C 冰箱中，培养基内之CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之CO2，以调整pH 值。

26. 各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？

不同厂牌的dish 或flask，其所coating 的polymer 不同，制造程序亦不同，虽对大部分细胞没有太大之影响，惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。

27. 购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？

研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。

28.购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？

研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80 °C 太久。

29. 收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？

冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。

30.L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？

L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。

31.GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？

GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。
GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。

32.什么培养基中可以省去加酚红？

酚红在培养基中用作PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。

33.如何用台盼兰计数活细胞？

用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000个/毫升，在0.1毫升细胞悬液中加0.1毫升0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色细胞是死细胞。

34.培养基中丙酮酸钠的作用是什么？

丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。

35.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？

二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。

36.室温下配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用时PH值是多少？

缓冲液PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃时，不同PH值。

50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃时，不同PH值

4°C	25°C	37°C
8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 8.9 9.0 9.1 9.2 9.3 9.4	8.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8	7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5

37.如何从T25瓶中转移sf9细胞？能用胰蛋白酶消化吗？

我们推荐使用脱落细胞的方法，此技术破坏性最小，生活力最高。通过使用巴斯德吸液管，让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下，才使用胰酶消化细胞。

38.胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞：

1. 去除培养基。

2. 用2ml 1xPBS（足以覆盖细胞表面）洗涤细胞，去除PBS。

3. 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆盖细胞表面）。

4. 37 ℃孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。

5. 向细胞中加入2ml 细胞培养液，移入锥形管，用2ml培养液洗瓶壁，移入同一锥形管中。（培养基中的FBS终止了胰酶的活性。）

6. 离心（1100rpm）沉淀细胞。去除培养基。

7. 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。

39.在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时，肝素的使用量是多少？

为了防止悬浮培养细胞聚集的形成，使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。

40.在重新冻存sf9细胞前，它可以传多少代？随着传代的次数的增加，它的感染能力会降低吗？

通常情况当细胞经过30次传代后，应该返回冻存。无论什么时候计数时，都应该检查细胞活力。如果超过95％的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍，细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降，它们的感染力将不在是有效的。

41.贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基，在放置几天后颜色变紫?

这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时，碳酸氢纳导致了pH值的上升。您可以在使用前松开瓶口，在CO2培养箱孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的pH值（确定松开瓶口以保证气体交换）。

42. 细胞培养基偶然被冻，可否继续使用？

如果细胞培养基偶然被冻，您应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以正常使用，如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基。

43. 无血清培养与有血清培养使用的抗生素量一样吗？

当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平。

44. 培养基中添加了血清和抗生素后，可长期保存吗？

一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。

45.培养基及其它添加物和试剂可反复冻融吗？

大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。

46.为什么要在溶解的一周内使用贮存在4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液?

胰蛋白酶在4℃就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变得不稳定。

47.保存血清最好的方法?

我们建议血清应保存在-5℃至-2O℃。若存放于4℃时，请勿超过一个月。若一次无法用完一瓶，建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。

48. 如何解冻血清才不会使产品质量受损?

将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。

49. 血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理?

血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。

若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。最好不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞过滤膜。

50. 为什么要热灭活血清?

加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养ES细胞、平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。

51. 有必要做热灭活吗?

实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。

若非必须，可以不需要做热处理这一步。不但节省时间，更确保血清的质量!

52. 为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?

有些胎牛血清产品没有预老化，储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在－20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。

53. 如何避免沉淀物的产生?

我们建议您在使用血清的时候，注意下列的操作:

(1)解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，非常容易产生沉淀物。

(2)解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。

(3)请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。

(4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。

(5)若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。

细胞培养中的支原体污染的预防及处理
Mycoplasma国内主要有三种译名，医学文献译为“支原体”（分枝原体，枝原体，类菌质体），动物医学文献译为“霉形体”或“支原体”，台湾、香港则译为微浆菌。

支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞型微生物。自然界分布广泛，种类多，有80余种，分为两个属：一为支原体属（Mycoplasma），有几十个种；另一为脲原体属（Ureaplasma），仅有一种。与人类感染有关的主要是肺炎支原体和解脲脲原体。

支原体无细胞壁，多呈不规则球状、长丝状，可分枝，营寄生共生或腐生。一般侵害对象为动植物，可造成多种疾病。

细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。国内外研究表明，95%以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和菜氏无胆甾原体（A.laidlawii），为牛源性。国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。

支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（某些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染，等等。

体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。

由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中的抗生素抗污染能力有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞手到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。

组织细胞培养工作中，可以从以下几方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基冲加入适量的抗生素。

抗生素主要用于消毒培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法。不同抗生素杀灭微生物不同，应根据需要选择。

在细胞培养过程中如果发现破碎的细胞甚多，培养细胞需要频繁改善营养环境才能支持长期传代培养时，应该怀疑支原体污染。支原体污染难以观察特殊的外观变化，培养液也不浑浊。

支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体，常用方法有：抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。要注意的是：支原体没有细胞壁，故作用于细胞壁生物合成的抗生素，如内酰胺类、万古霉素等是不敏感的；对多粘菌素、利福平、磺胺药物普遍耐火药。对支原体最有抑制活性抗生素是四环素类、大环内酯类等，氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小的抑制作用。必要时更换所有培养用物。通常，滤过除菌的方法对支原体是没有作用的。

由于一些微生物，如支原体，病毒等能通过滤膜，所以过滤药品仍潜在被外源微生物污染的危险，近年来，60Co辐射灭菌技术在医药、食品等领域广泛应用，由于辐射灭菌能够彻底杀灭所有微生物。有试验证实以2Mrad辐射处理的各培养基样品达到了无菌要求，经多批培养试验，辐射灭菌安全可靠；辐射灭菌的培养基营养性能不低于过滤组，证明辐射灭菌对培养基性能无不良影响；对血清的辐射灭菌试验效果也表明60COγ射线不影响培养效果。把干粉培养基经无菌操做定量分装于灭菌容器内，辐射后以干粉原型贮藏，不但培养基的纯净性得到保障，而且营养性能较过滤后以水溶液形式保存更稳定，对谷氨酰胺等这类水溶液不稳定者特别合适。

目前，有专门做支原体检测的试剂盒，可以用细胞滴片检测。市场上已有了新一代支原体抗生素M-Plasmocin，能有效的杀灭支原体，又不影响细胞本身的代谢，而且处理过的细胞不会重新感染支原体。另外，配合支原体检测试剂盒，可以帮助尽快发现支原体的污染。